Diferencias en la morfología testicular en ranas del género Eleutherodactylus (Anura) pertenecientes a tres microhábitats.

Autores:
Yamilka Rodríguez Gómez1, Ana Sanz Ochotorena2, María de Lourdes Segura Valdés3, Reyna Lara Martínez4, Luis Felipe Jiménez García5
1 Profesor Auxiliar,  Facultad de Biología, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba.
2 Profesor Titular,  Facultad de Biología, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba.
3 Profesor Titular,  Facultad de Ciencias, UNAM, México D.F., México
4 Técnico Docente,  Facultad de Ciencias, UNAM, México D.F., México
5 Profesor Titular,  Facultad de Ciencias, UNAM, México D.F., México
yami@fbio.uh.cu

RESUMEN

Las 52 especies cubanas del género Eleutherodactylus pueden ubicarse en microhábitats específicos pues poseen estrategias ecológicas diferentes, por ejemplo: hojarasca-suelo,  ribereñas-semiacuáticas y petrícolas-cavernícolas. De acuerdo a esto, podría esperarse que en especies que ocupen microhábitats diferentes algunas características testiculares puedan verse modificadas.  El objetivo de este trabajo es  comparar la morfología de los testículos de 10 especies del género Eleutherodactylus de tres microhábitats, para mostrar diferencias en su estructura.  Se colectaron cinco machos adultos de cada especie en Occidente (E.goini, E.zugi, E.riparius, E.pinarensis, E.thomasi y E.planirostris) y Oriente de Cuba (E.cuneatus, E dimidiatus, E.turquinensis y E.atkinsi).  En el laboratorio se extrajeron ambos testículos.  El testículo izquierdo se fijó en paraformaldehído (4%) y se incluyó en parafina por la técnica convencional. Los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina para ser observados al microscopio de campo claro.  El derecho se fijó en glutaraldehído (2.5 %) y se procesó para microscopía electrónica de transmisión.  La morfología de los testículos observadaes similar a la de otros anfibios anuros. Presentan una espermatogénesis cística.  La túnica albugínea y el tejido intersticial presentan características particulares que están en relación con su microhábitat.  A la presencia de pigmento  se le adjudica función protectora ante la exposición a los rayos solares, ya sea permanente (E.pinarensis y E.thomasi), durante las vocalizaciones (E.zugi) o la etapa juvenil (E.cuneatus y E.turquinensis).  El grosor de la túnica es mayor en las especies de hábitos más terrestres (E.atkinsi, E.dimidiatus, E.goini, E.planirostris, E.zugi, E.pinarensis y E.thomasi) que en las ribereñas (E.cuneatus, E riparius y E.turquinensis).
Palabras Clave: Eleutherodactylus, microhábitat, testículos, pigmentos.

INTRODUCCIÓN

La familia  Eleutherodactylidae es la más numerosa de los anfibios anuros de Cuba, con 52 especies incluidas todas en el género Eleutherodactylus1.  Estas ranitas miden entre 20 y 50 mm de longitud hocico-cloaca y a diferencia de muchas especies de las zonas templadas, se reproducen en la tierra y no tiene estadios larvales, los comúnmente denominados renacuajos.
Los lugares donde viven los anfibios pueden identificarse primero desde una perspectiva paisajista (montañas, llanuras, etc.) y luego teniendo en cuenta los microhábitats específicos donde se encuentran las especies. Dentro de las comunidades de anfibios cada especie posee una estrategia ecológica diferente. Según el uso de los microhábitats, las especies cubanas pueden clasificarse en: habitantes de la hojarasca-suelo,  semiarborícolas, arborícolas-bromeliadícolas, ribereñas-semiacuáticas, petrícolas-cavernícolas, y generalistas 2. En algunas ranas, los machos vocalizan desde perchas ubicadas a cierta altura, mientras que las hembras se mueven por el suelo o ascienden en busca de pareja. La atracción entre los sexos ocurre fundamentalmente por vocalizaciones que realizan los machos.  La emisión del canto ocurre preferentemente de noche pero en algunos casos puede también extenderse durante el día, en dependencia de las condiciones climáticas.
Existen evidencias en anfibios desde el punto de vista histológico de las diferencias en la estructura del espermatozoide atendiendo a la especie, pero también al modo de reproducción e incluso a la ubicación taxonómica 3,4. De acuerdo a esto, podría esperarse que en especies que ocupen microhábitats diferentes algunas características de la gónada puedan verse modificadas.  Por ello el objetivo de este trabajo es  comparar la morfología de los testículos de 10 especies del género Eleutherodactylus que pertenecen a los microhábitats de hojarasca-suelo, petrícola-cavernícola y ribereño-semiacuático, para mostrar diferencias en su estructura que puedan ser relacionadas con su microhábitat.  

MATERIAL Y MÉTODOS

Se colectaron cinco machos adultos de cada especie en sus localidades características de las regiones occidental y oriental de Cuba:
Occidente: E. goini y E. zugi en Pinar del Río, E. riparius en Artemisa, E. pinarensis y E. thomasi en Mayabequey E. planirostris en La Habana.
Oriente: E. cuneatus, E. dimidiatus y E. tuquinensis en Santiago de Cuba y E. atkinsi en Guantánamo.  
Las colectas se realizaron durante los meses de mayo-septiembre de los años 2008 al 2012.  En el laboratorio se extrajeron ambos testículos mediante una insición abdominal. 
El testículo izquierdo se fijó en paraformaldehído al 4% (Panreac) en PBS (0.01 M, pH 7.6)  y se incluyó en parafina (Paraplast®) por la técnica convencional. Los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina (Merck).  Las preparaciones fueron observadas en un microscopio óptico Nikon E800, con cámara digital para el registro fotográfico.
El testículo derecho se fijó en glutaraldehído al 2.5 % (Applichem) y se procesó para microscopía electrónica de transmisión (MET) 5. Los bloques obtenidos fueron cortados en un ultramicrótomo Leica Ultracut. Se obtuvieron cortes semifinos (200-400 nm) que fueron teñidos con azul de toluidina (Merck) y se observaron en un microscopio de campo claro Axiostar.  Los cortes ultrafinos se contrastaron utilizando acetato de uranilo (PolySciences) al 3 % y citrato de plomo (PolySciences) al 0.3 %.   Las rejillas contrastadas se observaron en un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM 1010 que opera a 80 kV y se realizó el registro digital de las imágenes en una computadora Pentium 3 acoplada al microscopio.

RESULTADOS

La morfología de los  testículos observada es similar a la de otros anfibios anuros.  Presentan una forma ovoide que incrementa su tamaño a medida que avanza el proceso de producción de células sexuales.  Se encuentran recubiertos por una capa de tejido conectivo fibroso denominada túnica albugínea, la cual desde su posición periférica al testículo, penetra y envuelve a numerosos compartimientos en su interior que son los denominados túbulos (o también lóbulos) seminíferos (Fig. 1). 
En los cortes transversales de testículo de todas las especies, se aprecia que la túnica albugínea está formada por fibras colágenas y fibroblastos.  No obstante, la túnica albugínea se observa más gruesa en todas las especies de hojarasca y las petrícolas (Fig. 2)  mientras que es muy fina en  las ribereñas (Fig. 3).
En el interior de los lóbulos seminíferos se ubican los cistos, por lo cual el patrón espermatogénico que presentan estas diez especies es cístico o por cistos. Estos cistos contienen las células germinales que se encuentran en una íntima relación morfofuncional con células somáticas, las células de Sertoli.  En ellos, las células germinales se hallan unidas en un mismo estadio de diferenciación por lo que su desarrollo es sincrónico (Fig. 2 y 3).
Los cortes analizados procedían de ejemplares adultos colectados en plena etapa reproductiva, por lo que se distinguieron en todos las preparaciones histológicas cistos de espermatogonias I, espermatogonias II, espermatocitos I, espermatocitos II, espermátidas y espermatozoides, los cistos más abundantes (Fig. 2, 3 y 4).
La túnica albugínea es transparente en una de las especies ribereñas (E. riparius)  y en cuatro de las cinco especies de hojarasca (E. atkinsi, E. dimidiatus, E. goini y E. planirostris) pues no se observó la presencia de pigmentos (Fig. 1, 2 y 3). Debido a lo anterior, macroscópicamente, podía observarse la organización de los túbulos muy cercanos unos de otros en el interior del testículo.  En el resto de las especies se observó la presencia de pigmentos en la túnica albugínea, donde se incluyen las dos especies petrícolas (E. pinarensis y E. thomasi), las otras dos especies ribereñas (E. cuneatus y E. turquinensis) y además E. zugi, que pertenece al grupo que habita en la hojarasca (Fig. 4).
El tejido intersticial entre los lóbulos seminíferos posee fibroblastos, fibras, vasos sanguíneos y otro tipo de células somáticas semejantes a las células de Leydig, de forma irregular, frecuentemente triangular (Fig. 5).  En este tejido intersticial se aprecian también pigmentos. Estos pigmentos se observan como gránulos electrodensos muy oscuros y abundantes entre los túbulos seminíferos (Fig. 5).

DISCUSIÓN

La presencia o no de pigmentos en la túnica albugínea e incluso en el tejido intersticial es una característica que destaca en estas especies. De Oliveira et al.6 y  Franco-Belusi et al.7 consideran que la pigmentación de los testículos es una característica poco usual, que se observa en algunas especies de anuros.  En el sapo Xenopus laevis y en otros vertebrados no mamíferos, las células con pigmentos pueden encontrarse en diferentes órganos, constituyendo un sistema de pigmentación extracutánea de función desconocida. Sin embargo, Sanz et al.8  describen pigmentos en gónadas de cuatro anfibios cubanos y le adjudica una función protectora frente a las radiaciones UV de la luz solar teniendo en cuenta que pigmento melanina es un biopolímero protector contra diversas agresiones citotóxicas y los rayos UV
En este sentido es consistente el hecho de que la presencia de pigmentos se encuentre en las especies que tiene una mayor exposición al sol, como es el caso de las especies petrícolas. Sin embargo, esta característica fue observada en los testículos de otras tres especies de hábitos no tan soleados.  En el caso de E. zugi, una especie de hojarasca, al analizar sus hábitos reproductores, se puede constatar que es la única especie de las cinco que se analizaron en este microhábitat que puede vocalizar también durante el día, no solo por la noche, como ocurre en las otras cuatro 2.  Algo similar ocurre con las dos especies ribereñas (E. cuneatus y E. turquinensis) en las cuales se han observado a los juveniles activos durante el día.  Pueden incluso tomar el sol en espacios sin cobertura boscosa, con temperaturas considerablemente superiores a las registradas para los adultos 8.
Sobre la diferencia encontrada entre el grosor de las  túnicas albugíneas de los testículos de las especies de hojarasca y las petrícolas con respecto a las ribereñas, esto puede ser un indicio de que las especies con hábitos más terrestres tienden a proteger su tejido seminífero de las radiaciones solares y otras agresiones físicas a las que se ven más expuestos que las especies con un hábitat más cercano al agua.  En estos ambientes puede haber más sombra y protección debido a la vegetación característica de las márgenes de los ríos y otros cuerpos de agua.
El patrón de espermatogénesis es cístico o por cistos, al igual que en peces  y anfibios en general 9,10,11 y muy diferente a lo que aparece en los vertebrados amniotas12.  El hecho de encontrarse células sexuales en todos los estadios de la espermatogénesis, pero mucho más abundantes los de espermatozoides, confirma que los animales colectados estaban en pleno apogeo reproductivo. 
En cuanto a las células de Leydig,  se presume que en anfibios también producen testosterona 9,13 al igual que en los mamíferos, en los cuales juega una función importante en el incremento del tamaño testicular y en la espermatogénesis 14. 

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

1. Rodríguez-Gómez, A. (2012): Anfibios. En H. González, L. Rodríguez, A. Rodríguez, C. Mancina, I. Ramos (Eds.) Libro rojo de los vertebrados de Cuba. Editorial Academia, La Habana, págs 55-91.
2. Díaz, L. M. y A. Cádiz (2008): Guía taxonómica de los anfibios de Cuba. Abc Taxa 4, i-vi, 294 págs.
3. Garda, A. A.; G. C. Costa; G. R. Colli y S. N. Báo (2004): Spermatozoa of Pseudinae (Amphibia, Anura, Hylidae), with a test of the hypothesis that sperm ultrastructure correlates with reproductive modes in Anurans. Journal of Morphology 261:196–205
4. Rodríguez-Gómez, Y. (2008): Morfología de las gónadas de cuatro especies del género Eleutherodactylus (Anura: Leptodactylidae). Tesis doctoral. Universidad de la Habana. Cuba. 98 págs.
5. Vázquez-Nin, G. H. y O. M. Echevarría (2000): Introducción a la Microscopía Aplicada a las Ciencias Biológicas (UNAM, Fondo de Cultura Económica, México, D.F.).
6. . Oliveira, C., Zanetoni, C. & Zieri, R. (2002): Morphological observations on the testes of Physalaemus cuvieri (Amphibia, Anura). Revista Chilena de Anatomía 20(3), 263-268.
Franco-Belusi, L.; R. Zieri; R. de Souza Santos; R. M. Moresco y C. de Oliveira (2009): Pigmentation in Anuran testes: Anatomical pattern and variation. The Anatomical Record 292, 178-182
7. Sanz, A.; M. L. Segura; Y. Rodríguez; R. Lara y L. F. Jiménez (2011): Pigmentos en los testículos de cinco anfibios endémicos cubanos (Eleutherodactylus turquinensis, E. cuneatus, E. glamyrus, Bufo longinasus longinasus y B. longinasus cajalbanensis). TIP 14(1): 85-92
8. Uribe, M. C. (2003): Vertebrate functional morphology. Reproductive systems of Caudata, Amphibians. H. M.

9. Dutta y J.S. Datta Munshi (Eds.) Science Publishers, Inc.  Sci. Pub. Inc. 267-293
10. Shalan, A. G.; S. D. Bradshaw;  P. C. Withers; G. Thompson; M. F. F. Bayomy;  F. J. Bradshaw y T. Stewart (2004): Spermatogenesis and plasma testosterone levels in Western Australian burrowing desert frogs, Cyclorana platycephala, Cyclorana maini, and Neobatrachus sutor, during aestivation. General and Comparative Endocrinology 136: 90-100
11. Smita, M.; O. V. Oommen; M. G. Jancy y M. A. Akbarsha (2004): Stages in spermatogenesis of two species of caecilians Ichthyophis tricolor and Uraeotyphlus cf. narayani (Amphibia: Gymnophiona): light and electron microscopy study.  Journal of Morphology 261: 92-104
12. Paniagua, P. (2002): Citología e histología vegetal y animal. McGraw-Hill Interamericana, España. 3era. Edición. 1002 págs.
13. Uribe, M. C. (2003): Reproductive biology and phylogeny of Urodela.  The testes, spermatogenesis and male reproductive ducts.  H. M. Dutta y J.S. Datta Munshi (Eds.) Science Publishers, Inc. 183-202
14. Gilbert, S. F. (2010): Developmental Biology (Ninth Edition, Sinauer Ass. Publishers) 711 págs.

 

ANEXOS

Figura 1: Corte de testículo de E. atkinsi teñido con hematoxilina-eosina donde se muestra la túnica albugínea (TA) y la organización en túbulos seminíferos (TS) donde ocurre la espermatogénesis cística. 100X

Figura 2: Corte de testículo de E. dimidiatus teñido con hematoxilina-eosina. Se muestra la túnica albugínea gruesa (TA) y cistos de espermatozoides (EZ). 1000X

Figura 3: Corte de túbulo seminífero (TS) de E. riparius teñido con azul de toluidina donde se observa la túnica albugínea fina (TA) y cistos en  varios estadios de desarrollo. 1000X

Figura 4: Corte de testículo de E. thomasi teñido con hematoxilina-eosina. Se muestra la túnica albugínea gruesa (TA) y el interior del testículo, completamente espermatogénico. 1000X

Figura 5: Fotomicrografía electrónica de testículo de E. pinarensis. Se observa una célula de Leydig (CL) en el tejido intersticial (TI) que se encuentra entre dos túbulos seminíferos (TS). Note la presencia de pigmentos (P). Barra 1μm