EFECTOS DE LA NEUTRALIZACION DEL FACTOR PRECOZ DE PREÑEZ SOBRE EL DESARROLLO DE LOS EMBRIONES Y EL PERFIL DE CITOQUINAS

Autores:
Maria Carolina Grosso1, Romina Valeria Bellingeri2, Carlos Eugenio Motta3, Fabrisio Eduardo Alustiza4, Natalia Yanina Picco5, Adriana Beatriz Vivas6

1 Ayudante de primera, Histología, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto. Argentina
2 Becario Postgrado tipo II CONICET, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto. Argentina
3 Ayudante de primera, Enfermedades transmisibles de pequeños animales, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto.
4 Ayudante de primera, Embriología, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto.
5 Becario Postgrado tipo II CONICET, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto. Argentina
6 Profesor Asociado, Histología, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto. Argentina

RESUMEN

El objetivo fue investigar el efecto de la neutralización del EPF por inmunización pasiva en ratas preñadas. Ratas preñadas post apareamiento se trataron con pAc anti-EPF, solución fisiológica e IgG Inespecífica y se sacrificaron a los 10 días de gestación. Se determinó número, peso y tamaño de los embriones, relación embriones/Cuerpos Luteos y estadio de desarrollo de los embriones por microscopía. Se tomaron muestras de sangre para determinar la concentración de IL10, INFg y TGFβ por ELISA. Se encontró una disminución significativa del número, tamaño, peso de los embriones y de la relación Embriones/CL en el grupo tratamiento. Los embriones del grupo tratado presentaron un estado de desarrollo compatible con 7 u 8 d de gestación, mientras que los embriones de los grupos controles presentaron una estadío de desarrollo acorde a la edad gestacional. La IL10 y el INFγ estuvieron significativamente aumentados en el grupo tratado y el TGFb significativamente disminuido. El tratamiento con los Ac anti-EPF afectó el crecimiento y desarrollo de los embriones, probablemente bloqueando parcialmente la funcionalidad del EPF como factor de crecimiento embrionario. La disminución en la relación embriones/CL sugiere pérdidas embrionarias, debido a un asincronismo entre el estado de desarrollo embrionario y del endometrio, al desbalance Th1/Th2 y/o a la disminución del TGFb. El EPF tiene funciones inmunomoduladoras y de factor de crecimiento siendo de gran importancia durante la gestación.

Palabras Clave: [FACTOR PRECOZ DE PREÑEZ; ANTICUERPOS; DESARROLLO EMBRIONARIO; BALANCE DE CITOQUINAS]

INTRODUCCIÓN

Una interrelación exitosa entre los tejidos maternos y embrionario durante el periodo pre-implantacional activa mecanismos que preparan la implantación y el desarrollo de la preñez. Se ha sugerido que los factores inmunosupresores derivados del conceptus y de la madre ayudan a proteger  al feto del rechazo inmunológico (Hunt 2006).
Morton et al. (1974) reportaron en murinos que la formación de rosetas espontáneas entre linfocitos y eritrocitos era inhibida cuando los linfocitos de macho o de hembras no preñadas eran preincubados con sueros de ratones preñadas. Este efecto inhibitorio fue causado por una sustancia asociada a la preñez llamada Factor Precoz de Preñez (Early Pregnancy Factor - EPF). Bajo condiciones fisiologías normales el EPF es detectado solo durante la preñez y liberado en respuesta a la presencia del embrión luego de 4 h post fertilización (Cavanagh et al. 1982). El EPF está compuesto por dos componentes llamados EPF-A y EPF-B que poseen diferentes sitios de síntesis. El EPF-A es sintetizado en oviducto durante el estro y la preñez, mientras que el EPF-B está asociado con la preñez exclusivamente y es producido por el ovario (periodo pre-implantational) y el embrión (periodos peri y post–implantacional) (Morton et al. 1992a). El EPF es un factor importante en el establecimiento de una preñez exitosa; pudiendo actuar como un factor de crecimiento y un agente inmunosupresor (Morton et al.1992b; Corrao et al. 2010). La presencia de EPF en cultivo de células tumorales relaciona este factor con la división celular sugiriendo un rol como factor de crecimiento autocrino, en la gestación actuaría preferentemente durante el primer estadio del desarrollo embrionario (Quinn et al. 1990). La función inmunosupresora puede ser mediada por la inducción de dos factores supresores solubles identificados en ratones y humanos, EPF-S1 (EPF-induced suppressor factor 1) y EPF-S2 (EPF-induced suppressor factor 2) (Rolfe et al. 1988, 1995). Además, el EPF disminuye signos clínicos de la encefalomielitis autoimmune en ratas y ratones, suprimiendo la respuesta inflamatoria, expresión de moléculas de adhesión e infiltración linfocitaria que inducen una desmielinización del sistema nervioso central (Zhan et al. 2003; Harness et al. 2003; Athanasas-Platsis et al. 2003).
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la inmunización pasiva con anticuerpos policlonales anti-EPF porcino sobre parámetros de desarrollo e inmunológicos durante el período pre-implantacional en ratas.

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de anticuerpos policlonales anti-EPF
En este estudio se desarrollo un anticuerpo policlonal contra EPF sintético (NH2 terminal). El extremo N-terminal fue obtenido  a partir de un suero de cerda de 7 días de preñez (Merkis 2000) con un peso molecular aproximado de 29 kDa. Los anticuerpos anti-EPF desarrollados en conejos fueron producidos y purificados por el método descripto por Grosso et al. (2008).

Inmunización pasiva de ratas preñadas con el anticuerpo anti-EPF 

Animales
Se utilizaron ratas Wistar (n=28) de aproximadamente 180-200g de peso, mantenidas en jaulas individuales con un régimen artificial de luz-oscuridad (12 horas: 12 horas). La comida y el agua fueron provistos ad libitum (Bioterio de la Facultad de Ciencias Exactas, Fisicoquímicas y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto, ARGENTINA).

Protocolo de apareamiento
Se estudio el ciclo estral a través de la evaluación de las células vaginales por microscopia óptica durante un mes hasta la aparición de ciclos regulares. Las ratas hembras se aparearon con machos (1:1) y el apareamiento fue confirmado a la mañana siguiente por la aparición de un espermatozoides en el lavaje vaginal (Día 1). Las ratas preñadas fueron colocadas en jaulas individuales nuevamente.

Grupos de animales e inmunización pasiva
Las hembras fueron inoculadas intra-peritonealmente a las 8, 16, 32 y 40 hs post apareamiento. De acuerdo a la solución administrada los animales fueron separados en tres grupos:
Grupo 1 (Control solución fisiológica): 8 ratas preñadas. Se aplicaron 100 µl de solución fisiológica salina estéril.
Grupo 2 (Control IgG inespecífica): 8 ratas preñadas. Se aplicaron 500 µg de IgG de conejo inespecífica diluidos en 100 µl de solución fisiológica salina estéril.
Grupo 3 (Tratamiento): 12 ratas preñadas. Se aplicaron 500 µg de IgG anti-EPF diluidos en 100 µl de solución fisiológica salina estéril.

Procedimiento quirúrgico
Las ratas fueron sacrificadas por decapitación en el día 10 de preñez. Se extrajo el tracto reproductivo (ovarios, oviductos, cuello y cuernos uterinos) y se lavó cuidadosamente con solución fisiológica estéril. Se contaron los cuerpos lúteos usando una lupa binocular. Se abrieron los cuernos uterinos por el lado anti-mesometrial, se contó el número total de sacos embrionarios, que luego se extrajeron cuidadosamente. Se tomaron muestras de suero para la cuantificación de citoquinas.

Parámetros de Fertilización y Desarrollo
De cada animal se registraron los siguientes datos:
Parámetros de fertilización: número total de embriones, número total de cuerpos lúteos y se calculó la relación embriones / cuerpo lúteo.
Parámetros de Desarrollo: peso (g) y longitud (mm) de los sacos embrionarios.

Estudio microscópico
Las muestras de sacos embrionarios fueron fijadas en formol buffereado pH 7.4 por 72 horas, deshidratadas e incluidas en parafina. Se realizaron cortes finos (3-4 mm) en un ultramicrotomo Leica. Los cortes fueron deshidratados y teñidos con Hematoxilina-Eosina (HE) según protocolos convencionales. Se examinaron las secciones teñidas en un microscopio óptico Axiophot (Carl Zeiss) y se tomaron microfotografías.

Parámetros Inmunológicos
Se midió INF-γ, IL-10 (EndogenÒ ERIFNG/ERIL10 Pierce Biotechnology, Inc.) yd TGF-β (QuantikineÒ, R&D Systems). En todos los casos se procedió según instrucciones de los fabricantes.

Análisis estadístico
Todos los valores fueron expresados como media ± SEM y los datos fueron evaluados por ANOVA por la prueba LSD usando el software STATISTICA 6.0 (Stafsoft Inc., Tulsa, Oklahoma, USA). Todos los experimentos fueron realizados por triplicado para asegurar validez. Las diferencias fueron consideradas significativas con p <0.05. La matriz de correlación entre IL-10 e INF-g fue llevada a cabo con un 95% de confianza y p <0.05.

RESULTADOS

Inmunización pasiva de ratas preñadas con anticuerpo anti-EPF

Parámetros de Fertilización
El tratamiento de ratas durante el periodo pre-implantacional con el anticuerpo policlonal anti-EPF porcino resultó en un menor número promedio de embriones por madre comparado con los grupos control (P < 0.05 – Tabla 1). Se observó una disminución significativa en la proporción embrión/cuerpo lúteo en el Grupo tratamiento en comparación con los Grupos controles (P < 0.01 – Tabla 1).

Parámetros de Desarrollo
Los parámetros de desarrollo también fueron afectados con el tratamiento con anticuerpo anti-EPF porcino. El anticuerpo inhibió el normal crecimiento de los embriones. Los pesos y longitudes de los sacos embrionarios en el grupo tratamiento fueron significativamente menores que los observados en los grupos controles (P <  0.05) (Tabla 1).

Estudio microscópico
La inhibición del crecimiento de los embriones del grupo tratado estuvo acompañada por un retraso en su desarrollo. Los embriones del grupo tratamiento mostraron de uno a dos días de retraso en el desarrollo comparados con los grupos control. Estos embriones correspondían a una gestación de 8.5-9 días: no se observó formación de somitas, no pudo distinguirse el alantoides y el intestino estaba desarrollado (Figura 1b). Por el contrario, los embriones del grupo control mostraron un estado de desarrollo normal correspondiéndose con una gestación de 10 días (Figura 1a).

Parámetros inmunológicos
Para evaluar los efectos de la neutralización del EPF sobre los mecanismos inmunológicos de la preñez se evaluaron las concentraciones de citoquinas tipo Th1 (INF-γ), Th2 (IL-10) y Th3 (TGF-β). Las concentraciones de IL-10 e INF-γ en el grupo tratado fueron significativamente mayores comparado con los grupos controles (P < 0.01). En contraste, la concentración de TGF-β fue significativamente menor en el grupo tratado (P < 0.01) (Tabla 2).
El grupo tratado con el anticuerpo anti-EPF mostró una relación INF-γ/IL-10 significativamente menor (P < 0.01) comparado con los grupos controles (Tabla 2). Más aun, hubo una correlación positiva entre las concentraciones séricas de IL-10 e INF- γ (r = 0.84, P < 0.05).

DISCUSIÓN

El presente estudio demostró que la inmunización pasiva con el anticuerpo anti-EPF porcino tuvo efectos nocivos en el desarrollo embrionario temprano de la rata. Este hecho revela, al menos, el EPF de la rata y el EPF del cerdo comparten epitopes.
En este trabajo, la administración de un anticuerpo anti-EPF disminuyó el número total de embriones de rata, esto concuerda con Athanasas-Platsis et al (1989) quienes llevaron a cabo el experimento en ratones. A diferencia de estos autores, en este trabajo todas las ratas tratadas con anti-EPF mantuvieron su preñez. Sin embargo, el bloqueo de EPF mediado por anticuerpos causó una disminución significativa de la proporción embrión/cuerpo lúteo comparado con los valores de los grupos controles. Debido a que el grado de ovulación (calculado por el número promedio de cuerpos lúteos) observados en los tres grupos estudiados fue similar, la disminución en la relación embrión/cuerpo lúteo refleja un número menor de embriones viables en el grupo tratado a los 10 días de gestación.
Para una implantación exitosa se requiere una excelente sincronización entre los estadios embrionarios y el desarrollo del endometrio. Por ello, una falla en la implantación podría ocurrir debido al retraso en el crecimiento y desarrollo de los embriones causado por el tratamiento con el anticuerpo anti-EPF. Además, la longitud y el peso de los sacos embrionarios fue significativamente menor luego del bloqueo del EPF, mostrando un rol importante del EPF en el primer periodo de la preñez como factor de crecimiento. El estudio microscópico mostró que la disminución en el peso y longitud de los embriones gestados durante la aplicación del anticuerpo anti-EPF corresponden a un retardo marcado en sus estadios de desarrollo. Las características embriológicas de los embriones tratados con anticuerpos anti-EPF corresponden a las de embriones de 8.5 a 9 días de gestación, sin la formación de somitas o desarrollo de la placa neural. Por otro lado, los embriones que reciben la inoculación de soluciones control presentan una mayor longitud y grado de desarrollo, con características típicas de embriones de 10 días: presencia de somitas occipitales, cervicales y torácicas y desarrollo de intestino anterior medio y posterior. Estudios realizados por Quinn et al. (1990) revelaron que el EPF posee un rol de factor de crecimiento autócrino en células tumorales. Se sabe que los embriones experimentan en las primeras horas de gestación una serie de divisiones mitóticas que producen un alto incremento en el número celular. Este crecimiento exponencial podría ser la causa por la cual el EPF es requerido para el crecimiento y desarrollo de embriones normales. El retraso en el desarrollo observado luego del tratamiento con anticuerpos anti-EPF sugiere que su administración puede modular, al menos parcialmente, la funcionalidad del EPF como factor de crecimiento. Otros investigadores también han estudiado la importancia del EPF en ratones durante los periodos  pre- y post-implantacional aplicando anticuerpos anti-EPF durante estos estadios y observaron pérdida embrionaria y retardo en el desarrollo embrionario (Athanasas-Platsis et al. 1989, 1991, 2000).
El EPF puede estar actuando indirectamente en los primeros estadios de la preñez estimulando caminos importantes para el desarrollo embrionario. Es bien conocido que el EPF posee, además, una actividad como agente inmunosupresor (Grosso et al. 2007). Se ha sugerido que la acción inmunosupresora del EPF puede tener una influencia directa en los linfocitos a través de receptores de alta afinidad para este factor, que puede ser presentado por células CD4+, CD8+, NK y monocitos. Debido a que estas células son efectoras de la respuesta inmunológica mediada por células y están implicadas en el establecimiento de la gestación, la influencia directa del EPF sobre estas células podría ser la razón para su importancia en una implantación exitosa y un desarrollo embrionario normal (Harness et al. 2003; Athanasas-Platsis et al. 2003, 2004).
El IFN-γ es una citoquina anti-inflamatoria involucrada en la defensa inmunológica contra microorganismos intracelulares que determinan una respuesta inmune adaptativa con un patrón Th1. Por otro lado, IL-10 es una citoquina pro-inflamatoria que determina una respuesta inmune con un patrón Th2. En este estudio ambas citoquinas aumentaron como consecuencia del tratamiento con anticuerpos anti-EPF, se encontró que ambas citoquinas aumentaron más del doble y que existe una correlación positiva entre estas dos citoquinas independientemente del tratamiento. La disminución de numero, longitud y desarrollo de los embriones, así como también en la proporción embrión/cuerpo lúteo del grupo tratado con anti-EPF podría deberse a una falla en el balance de las citoquinas Th1/Th2. La disminución en la proporción INF-g/IL-10 en el grupo tratado refleja este desbalance de citoquinas Th1/Th2; este pudo deberse a un mayor incremento de IL-10 que de INF-g. El desbalance Th1/Th2 ha sido asociado con múltiples fallas en la gestación  y retardo del crecimiento intrauterino (Hahn-Zoric et al. 2002; Nan et al. 2007). Se encontró una disminución significativa en los niveles séricos de TGF-b en las ratas del grupo tratado con el anticuerpo anti-EPF versus los grupos controles. El TGF-b es una citoquina tipo Th3 que puede poseer efectos reguladores y protectores, contribuyendo a la tolerancia durante la gestación de la rata (Zhang et al. 2004). En resumen, estos resultados sugieren que durante la preñez existen algunos mecanismos que producen una regulación negativa en la expresión de algunas o todas las citoquinas. Si estos mecanismos se interrumpen entran en juego respuestas celulares citotóxicas maternas. El EPF y sus factores supresores, pueden suprimir estas respuestas maternas  para que el embrión lleve a cabo un crecimiento y desarrollo normal.

CONCLUSIONES

Podemos concluir que el bloqueo del EPF mediado por anticuerpos causa un retardo en el desarrollo embrionario, acompañado de disminución del peso y longitud de los embriones, así como también pérdida embrionaria. El EPF sería un factor regulador importante en el balance de citoquinas que asegura una atmosfera inmunológica adecuada para llevar a cabo la gestación. Por lo tanto, el EPF es una molécula importante que de una manera directa o indirecta participa en la compleja interacción que lleva a una preñez exitosa cumpliendo funciones inmunomoduladoras y de factor de crecimiento.

BIBLIOGRAFÍA

1. Athanasas-Platsis S, Quinn K, Wong T, Rolfe B, Cavanagh A, Morton H. (1989) Passive immunization of pregnant mice against Early Pregnancy Factor causes loss of embryonic viability. J Reprod Fertil. 87, 495-502.
2. Athanasas-Platsis S, Morton H, Dunglison G, Kaye P. (1991). Antibodies to Early Pregnancy Factor retard embryonic development in mice in-vivo. J Reprod Fertil. 92, 443-451.
3. Athanasas-Platsis S, Corcoran C, Kaye P, Cavanagh A, Morton H. (2000). Early pregnancy factor is required at two important stages of embryonic development in the mouse. Am J Reprod Immunol. 43, 223-233.
4. Athanasas-Platsis S, Zhang B, Hillyard N, Cavanagh A, Csurhes P, Morton H, McCombe P. (2003). Early Pregnancy Factor suppresses the infiltration of lymphocytes and macrophages in the spinal cord of rats during experimental autoimmune encephalomyelitis but has no effect on apoptosis. J Neurol Sci. 15(214), 27-36.
5. Athanasas-Platsis S, Somodevilla-Torres M, Morton H, Cavanagh A. (2004). Investigation of the immunocompetent cells that bind Early Pregnancy Factor and Preliminary studies of the Early Pregnancy 6. 6. Factor target molecule. Immunol Cell Biol. 82, 361-369.
7. Cavanagh A, Morton H, Rolfe B, Gidley-Baird A. (1982). Ovum Factor: a first signal of pregnancy? Am J Reprod Immunol. 2, 97-101.
8. Corrao S, Campanella C, Anzalone R, Farina F, Zummo G, Conway de Macario E, Macario A, Cappello F, La 9. Rocca G. (2010). Human Hsp10 and Early Pregnancy Factor (EPF) and their relationship and involvement in cancer and immunity: Current knowledge and perspectives. Life Sciences 86, 145-152.
10. Grosso MC, Cuello M, Martinez R, Schade R, Henklein P, Moroy M, Artero E, Greco C, Vivas A. (2007). Effect of Early Pregnancy Factor on pig lymphocytes proliferation. Biocell 31(2), 299.
11. Grosso MC, Cuello MF, Martínez RA, Greco CR, Henklein P, Schade R, Vivas AB. (2008) Evaluación de la especificidad de anticuerpos policlonales aviarios y mamíferos anti-Factor Precoz de Preñez porcino. Inmunología 27(1):1-10.
12. Hahn-Zoric M, Hagberg H, Kjellmer I, Ellis J, Wennergren M, Hanson L. (2002). Aberrations in placental cytokine mRNA related to intrauterine growth retardation. Pediatr Res. 51(2), 201-206.
13. Harness J, Cavanagh A, Morton H, McCombe P. (2003). A protective effect of Early Pregnancy Factor on experimental autoimmune encephalomyelitis induced en Lewis rats by inoculation with myelin basic protein. J Neurol Sci. 15(216), 33-41.
14. Hunt J. (2006). Stranger in a strange land. Immunol Rev. 213, 36-47.
15. Merkis C. (2000). Caracterización del Factor Precoz de Preñez (EPF): su extracción y purificación en suero de cerdos. Argentina, Río Cuarto: Universidad Nacional de Río Cuarto; Tesis Doctoral.
16. Morton H, Hegh V, Clunie G. (1974). Immunosuppression detected in pregnant mice by rosette inhibition test. Nature 249, 459-460.
17. Morton H, Cavanagh A, Athanasas-Platsis S, Quinn K, Rolfe B. (1992). Early Pregnancy Factor has immunosuppressive and growth factor properties. Reprod Fertil Dev. 4, 411-422.
18. Morton H, Rolfe B, Cavanagh A. (1992) Early Pregnancy Factor. Semin Reprod Endocrinol. 10, 72-82.
19. Nan C, Lei Z, Zhao Z, Shi L, Ouyang Y, Song X, Sun Q, Chen D. (2007). Increased Th1/Th2 (IFN-gamma/IL-4) cytokine mRNA ratio of rat embryos in the pregnant mouse uterus. J Reprod Dev. 53(2), 219-228.
20. Quinn K, Athanasas-Platsis S, Wong T, Rolfe B, Cavanagh A, Morton H. (1990) Monoclonal antibodies to Early Pregnancy Factor perturbs tumor cell growth. Clin Exp Immunol. 80, 100-108.
21. Rolfe B, Cavanagh A, Quinn K, Morton H. (1988). Identification of two Suppressor Factors Induced by Early Pregnancy Factor. Clin Exp Immunol. 73, 219-225.
22. Rolfe B, Athanasas-Platsis S, Hoskin M, Morton H, Cavanagh A. (1995). Purification and partial characterization of an Early Pregnancy Factor-Induced Suppressor Factor (EPF-S1). Am J Reprod Immunol. 33, 485-494.
23. Zhang B, Walsh M, Nguyen K, Hillyard N, Cavanagh A, McCombe P, Morton H. (2003). Early pregnancy factor suppress the inflammatory response and adhesin molecule expression in the spinal cord of SJL/J mice with experimental autoimmune encephalomyelitis and the delayed-type hypersensitivity reaction to trinitrochlorobenzene in normal BALB/c mice. J Neurol Sci. 5(212), 37-46.
24. Zhang Q, Huang Y, Hu Y, Wei G, Lu S, Zhao Y. (2004). Predominant Th2-type response during normal pregnancy of rats. Acta physiologica Sinica 56(2), 258-262.

ANEXOS

TABLAS

Tabla 1: Parámetros de fertilización y desarrollo de ratas preñadas y sus embriones

CL, cuerpo lúteo; los valores se expresan como el promedio ± SEM; *P<0.05; **P<0.01 iii versus i y ii.

Tabla 2: Parámetros inmunológicos en sueros de ratas preñadas

 

 

 

 

n, número de ratas, los valores se expresan como el promedio ± SEM, *p<0.05, **p<0.01 i versus ii y iii.

PIE DE IMAGEN

Fig. 1Aspecto microscópico de embriones de 10 días de gestación luego de la  inmunización pasiva de ratas preñadas con anticuerpo anti-EPF porcino. Microfotografías ilustrando el estadio de desarrollo de embriones (a) grupo control de solución salina - 20X (b) grupos tratado con anticuerpo anti-EPF - 10X. H/E RM: Membrana de Reicher’t; S: Somitas; EC: Cavidad ectoplacentaria; E: Exoceloma; AC: cavidad amniótica; VS: saco vitelino.