Morfovirtual2012, Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas

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Determinación de apoptosis en placentas de ratas estresadas crónicamente.

Autores:
Cots, Débora1, Merkis, Cecilia2, Rolando Alicia3, Alustiza Fabrisio4, Diaz Tomás5, Borghi Damiana6, Romanini María Cristina7.
1 Becaria de CONICET; Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC), Río Cuarto, Argentina.
2 Jefe de Trabajos Prácticos, UNRC, Río Cuarto, Argentina.
3 Profesor Asociado, UNRC, Río Cuarto, Argentina.
4 Ayudante de Primera, UNRC, Río Cuarto, Argentina.
5 Becario de CONICET, UNRC, Río Cuarto, Argentina.
6 Ayudante de Primera, UNRC, Río Cuarto, Argentina.
7 Profesor Adjunto, UNRC, Río Cuarto, Argentina

debora.cots@gmail.com

RESUMEN

Durante la preñez, es esencial el balance entre la diferenciación, proliferación y muerte celular para mantener la homeostasis en este tejido. El estrés crónico puede alterar diversos mecanismos que mantienen este balance. La apoptosis es un proceso involucrado en el normal desarrollo placentario, contribuyendo principalmente a  su remodelación. El objetivo del presente estudio fue determinar la apoptosis por TUNEL e inmunolocalización de Caspasa-3 en placentas de ratas estresadas crónicamente. Se utilizaron ratas Wistar que se dividieron en dos grupos: control y estrés, estresadas por inmovilización. Se sacrificaron a los 12, 17 y 21 días de la preñez. Se obtuvieron las placentas que fueron procesadas por técnicas histológicas convencionales. Los cortes de placenta fueron inmunomarcados con un anticuerpo anti-caspasa3 y por TUNEL. El índice apoptótico no presentó diferencias significativas entre grupos, pero si entre los estadios gestacionales. El índice mostró una disminución hacia el día 17 y luego, un incremento hacia el día 21. La placenta sufre cambios a medida que avanza la gestación. Como consecuencia, la apoptosis se incrementa hacia el final de la gestación. Estos resultados nos llevan a concluir que la apoptosis es un proceso biológicamente muy importante que contribuye a la correcta formación de la placenta y a la formación correcta de la estructura placentaria, llevando a buen término la preñez. De acuerdo con los resultados obtenidos a partir de la inmunolocalización de Caspasa-3 podemos concluir que en todos los estadios gestacionales analizados y en ambos grupos, la apoptosis se produce a través de una vía caspasa-dependiente.
Palabras Clave: apoptosis, estrés, placenta.

INTRODUCCIÓN

La placenta es un tejido extraembrionario que se localiza entre los compartimientos materno y fetal (Unek et. al., 2011). Esta importante estructura cumple funciones altamente especializadas durante la gestación que son críticas para el desarrollo normal del embrión/feto (Soares et. al., 1996; Georgiades et. al., 2002). La placenta realiza la mayoría de las funciones de los órganos fetales a través de la gestación debido a la inmadurez del embrión (Acevedo Gallegos y col., 2008).
El desarrollo normal del tejido placentario es crucial para el crecimiento fetal, las alteraciones que impacten sobre este tejido serán críticas en todas las etapas de la preñez, desde la implantación hasta el parto (González, 2006).
Los roedores desarrollan dos estructuras placentarias: la placenta coriovitelina que se desarrolla en la primera etapa de la gestación hasta el día 11 y la placenta corioalantoidea que muestra un significativo desarrollo en la segunda etapa de la gestación, a partir del día 12. Se pueden distinguir dos regiones funcional y morfológicamente diferentes denominadas zona de laberinto (ZL) y zona de unión (ZU) (Burdon et. al., 2007). Teniendo en cuenta la morfofisiología, en la placenta corioalantoidea se pueden diferenciar cuatro fenotipos celulares principales: (1) células gigantes del trofoblasto, (2) células del espongioblasto, (3) células glicogénicas y (4) células del trofoblasto sincitial (Davies and Glasier, 1968; Soares et. al., 1996; Georgiades et. al., 2002; Ain et. al., 2003; Pijenborg and Vercruysse, 2005).
La supervivencia de los organismos adultos y durante el desarrollo depende del mantenimiento y constancia del medio interno u homeostasis. Diferentes estímulos denominados agentes estresantes pueden amenazar este equilibrio (Kant et al., 1987; Natelson et al., 1981; Vigas et al., 1980).
Las situaciones estresantes activan simultáneamente los ejes hipotálamo-hipófiso-adrenal (HHA) y simpático-médulo-adrenal (SMA) (Vigas et. al., 1980; Armario et. al., 1981; Kant et. al., 1987; Martí et. al., 1999; Shulkin, 1999). La hormona liberadora de corticotropina (CRH), secretada por el hipotálamo estimula la secreción por parte de la hipófisis de la hormona liberadora de adenocorticotropina (ACTH) (Inder et. al., 2001). Por su parte, la ACTH estimula la secreción de glucocorticoides por la corteza adrenal. A lo largo de la preñez, la CRH también es producida por la placenta y posee la misma actividad biológica que la producida a través del eje HHA (Mulder et. al., 2002; Rodriguez, N et. al., 2007). El eje SMA, libera finalmente adrenalina y noradrenalina para restaurar la condición de homeostasis (Mayer et. al., 2011).
Los glucocorticoides maternos en condiciones estresantes pueden causar efectos adversos en relación con el crecimiento y desarrollo de la placenta, como la alteración de dos procesos importantes durante la gestación: apoptosis y proliferación celular. El balance entre la diferenciación, proliferación y muerte celular es esencial para la mayoría de los procesos fisiológicos que ocurren durante la gestación y en conjunto mantienen la homeostasis tisular (Burton and Waddell, 1999; Chan et. al., 1999; Acar et. al., 2008; Meresman et. al., 2010).
La apoptosis en un fenómeno biológico que consiste en una respuesta celular activa y regulatoria frente a un estímulo específico (Austgulen et. al., 2002; Angosto, 2003; Barrio et. al., 2003). Este proceso ocurre en todos los tipos celulares presentes en el tejido placentario y es reconocido como un proceso fisiológicamente importante para el normal crecimiento y desarrollo placentario (Mu et. al., 2003; Straszewski-Chavez et. al., 2005).
La apoptosis se puede realizar mediante dos vías diferentes: 1) vía caspasa-dependiente, la cual involucra una familia de proteínas relacionadas denominadas caspasas (Hua et. al., 1999; Jerzak and Brischof, 2002; Elinos Baez y col., 2003; Rodriguez, M. y col., 2011) y 2) vía caspasa-independiente, la cual involucra al factor inductor de apoptosis (AIF) localizado en la mitocondria, el cual migra hacia el núcleo frente a algún daño genotóxico y causa apoptosis mediante la destrucción del mismo.
Existen varias características morfológicas que distinguen al proceso de apoptosis, estas incluyen la disminución del volumen celular, la fragmentación nuclear, la modificación del citoesqueleto, la condensación de la cromatina y la degradación del ADN en fragmentos nucleosomales. Como consecuencia de lo anterior se forman cuerpos apoptóticos que son fagocitados rápidamente por macrófagos sin respuesta inflamatoria (Degterev, A. et al., 2003; Elinos-Baez, C. y col, 2003; Zou, H. et al., 1999; Barrio, E. y col., 2003).
El objetivo del presente estudio fue determinar apoptosis por TUNEL y por inmunolocalización de caspasa-3 en placentas de ratas estresadas crónicamente.

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales Se utilizaron hembras primíparas de la cepa Wistar jóvenes (90 a 120 días de edad) de 200 a 300 grs. Se alojaron de a cuatro ejemplares por jaula en condiciones  estándar de bioterio a  temperatura de 22 ± 2 °C, fotoperiodo controlado, (12 hs. luz, de 7.30 a.m. a 7.30 p.m), humedad ambiente, con alimentación e hidratación ad-libitum (Las instalaciones del laboratorio fueron las adecuadas según la disposición 6344/96 de la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica, Argentina. Para el manejo de los animales de laboratorio se siguieron las conclusiones y recomendaciones de la reducción, refinamiento y reemplazo de animales de laboratorio proveniente de la declaración de Bologna-Russell and Burch, 1959. Todos los experimentos fueron llevados a cabo de acuerdo a los principios y procedimientos de la Guía de  Uso y Manejo de animales de Laboratorio (Publicación NIH nº 85-23, revisada en 1985, http: //www.nih.gov/sigs/bioethics). Se realizó el ciclado de las hembras por medio de colpocitogramas en fresco y se determinó el día del estro. Se colocó luego un macho de la misma cepa, por el término de 12 a 18 horas, y se verificó la cópula por la presencia de espermatozoides en exudados en fresco de la vagina de la hembra. Considerándose a éste el día cero de la preñez. Las hembras preñadas fueron separadas en dos grupos: Control (C) y Estrés (E).
Tratamiento experimental A partir del cuarto día de la gestación, las hembras preñadas del grupo E fueron colocadas por 45 minutos en cilíndricos plásticos, 3 veces a la semana, durante la mañana a tiempos variables. Este tipo de estrés fue elegido porque se considera que ejerce una influencia indirecta sobre el tejido placentario por una vía directa de estrés en la madre. Este proceso se realizó hasta el sacrificio de las hembras. Las ratas preñadas de ambos grupos fueron sacrificadas a los días 12, 17 y 21 de la gestación. Estos días fueron elegidos porque en el día 12 de la gestación se completa la formación de la placenta definitiva, en el día 17 la placenta experimenta su máximo tamaño y en el día 21 se observa una placenta a término. Se obtuvieron siete (7) ratas por casa estadio gestacional de cada grupo (n=21 por grupo). Las placentas fueron removidas y fijadas en buffer formaldehido y procesadas de acuerdo con técnicas histológicas convencionales.
Técnica inmunohistoquímica. Inmunolocalización de Caspasa-3 Los cortes histológicos fueron incubados por 10 min enH2O2 al 3% para el bloqueo de la peroxidasa endógena. Fueron incubados luego con el anticuerpo primario: anti-caspasa 3 (anticuerpo policlonal de conejo, Chemicon, Sigma) durante toda la noche a 4ºC seguido por la incubación con el anticuerpo secundario biotilinado (Laboratorio Vector) durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se incubaron con el complejo Avidina-Biotina- Inmunoperoxidasa (Complejo ABC, kit Vectastain, Laboratorio Vector) por 30 min. Finalmente, los cortes fueron incubados con 3-3´-diaminobenzidina (DAB) in presencia de H2O2 para revelar y contrastados con hematoxilina.
Terminal deoxynucleotidyl transferase dUtp nick end labelling (TUNEL) La técnica fue realizada según el protocolo del kit Apoptag Plus in situ Apoptosis Peroxidase (Oncor, USA)
Las secciones hidratadas fueron incubadas con proteinasa K durante 8-10 minutos en cámara húmeda. El bloqueo de la peroxidasa endógena fue realizado con peróxido de hidrógeno al 3%. Después del lavado con PBS, los cortes histológicos fueron incubados con buffer de equilibrio a temperatura ambiente. Luego, fueron incubadas con la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y digoxigenina dUtp a 37ºC en cámara húmeda. La reacción fue detenida con Buffer stop/Wash y luego incubadas con solución anti-digoxigenina-peroxidasa por 30 min a temperatura ambiente, revelados con DAB y contrastados con hematoxilina. Los controles negativos fueron procesados en ausencia de la enzima TdT. Se usaron cortes de glándula mamaria normal como controles positivos.
Análisis cuantitativo Se determinó el porcentaje de células positivas de cada corte de tejido placentario inmunomarcado. Siete imágenes de cada corte histológico fueron digitalizadas, totalizando 147 imágenes de cada grupo. Se utilizó un microscopio Zeiss Axioscope con una cámara digital Sony de 3.2 Mpx.
La incidencia de la apoptosis fue determinada en cada corte de tejido placentario en los diferentes estadios gestacionales (12, 17 y 21 días de gestación), usando el Índice de Apoptosis (IA). El índice fuer determinado como el porcentaje entre el número de células apoptóticas (inmunmarcadas) y el número de células totales, multiplicado por 100.
Análisis estadístico Se realizó un ANOVA para determinar diferencias significativas entre los grupos C y E y entre los estadios gestacionales. En cada caso, p≤0.05 fue considerado estadísticamente significativo.

RESULTADOS

TUNEL
Diferentes zonas de la placenta con núcleos normales y apoptóticos se muestra en la figura 1.
En los cortes histológicos de la placenta del día 12 C y E, se observaron células apoptóticas en ambas zonas placentarias. En ratas C del día 17 de la gestación, las células apoptóticas fueron observadas principalmente en la ZU y en mayor porcentaje que en el grupo control del mismo día de gestación, mientras que en ratas del día 21 de gestación, las células apoptóticas fueron observadas principalmente en la ZL.
El IA fue analizado. En el día 17 de gestación en ambos grupos, C y E la apoptosis disminuye con respecto al día 12, mientras que se observa un incremento de la apoptosis hacia el día 21 de preñez. Ambos grupos fueron comparados y se determinó que en el día 17 el IA fue mayor en el grupo C con respecto al grupo E, mientras que en los días 12 y 21 de la gestación el IA fue mayor en el grupo E. Los datos se muestran en el gráfico 1.
Los resultados del ANOVA revelan diferencias significativas entre los estadios gestacionales (p=0.00003) y diferencias no significativas entre grupos (p=0.35). Se realizó un test a posteriori para determinar diferencias significativas existentes entre los estadios gestacionales. Los resultados obtenidos fueron: se observaron diferencias significativas entre los días 12 y 17 (p=0.00017) y 17 y 21 (p=0.001), pero no entre los días 12 y 21 (p=0.254).

Inmunolocalización de Caspasa-3
Esta técnica fue realizada para determinar si el proceso apoptótico ocurrió a través de una vía caspasa-dependiente, o por el contrario, a través de una vía caspasa-independiente. Células positivas para Caspasa-3 fueron observadas en todas las muestras analizadas. En los días 12 y 21 de la gestación, la inmunolocalización de Caspasa-3 fue localizada principalmente en el citoplasma de las CS en la ZL. Por otro lado, en el día 17 de la gestación, la inmunolocalización de Caspasa-3 fue localizada en el citoplasma de CG y CGT de la ZU.
Diferentes zonas de la placenta con núcleos normales e inmunomarcados con Caspasa-3 se observan en la Figura 2.

DISCUSIÓN

La apoptosis fue demostrada en el desarrollo placentario normal a lo largo de la gestación. En línea con otros estudios, nuestro trabajo ha mostrado que el proceso apoptótico se observa en condiciones normales del desarrollo placentario (grupo Control).
El proceso apoptótico fue observado en ambas zonas placentaria. En la ZL, la apoptosis fue observada principalmente en las CS, mientras que en la ZU fue observada en las CGT. Nuestros resultados fueron similares a los obtenidos por Waddell et. al. (2000), quien primero propuso que la apoptosis fue claramente evidente en ambas zonas placentarias y que fue particularmente prevalente en la ZU hacia el final de la gestación. Estos autores han demostrado además, que la apoptosis en la ZU fue estimulada por un incremento de glucocorticoides.
Barrio et. al. (20009) propone que la apoptosis se incrementa hacia el final de la gestación. En concordancia con estos autores, hemos demostrado una significativa disminución de la apoptosis  hacia el día 17 de la gestación, seguido por un incremento hacia el final de la gestación en ambos grupos C y E.
Se observaron diferencias significativas en el IA entre los estadios gestacionales analizados, particularmente entre los días 12 y 17 y 17 y 21, pero no entre los días 12 y 21. Estos resultados se deben a que la placenta sufre cambios a medida que avanza la gestación. Como consecuencia, la apoptosis se incrementa hacia el final de la gestación. Nuestros resultados muestran que los núcleos TUNEL-positivos decrecen gradualmente desde el día 12 hacia el día 17 y gradualmente se incrementan hacia el día 21. Para el grupo E, los patrones inmunohistoquímicos fueron similares a los observados en el grupo C. Sin embargo, el número de núcleos apoptóticos en placentas del grupo E fue mayor que en el grupo C en los días 12 y 21, mientras que el número fue mayor en el grupo C en el día 17.
Por otro lado, el análisis estadístico no revela diferencias significativas entre los grupos estudiados. Si bien frente a la exposición a un agente estresor, se activan los ejes HHA y SMA con un incremento en la liberación de glucocorticoides, los individuos responden de manera particular frente a un estímulo estresor idéntico (Mulder et. al., 2002). Normalmente, la placenta actúa como un órgano amortiguador de los efectos producidos por el estrés aplicado. Debido a que la placenta realiza muchas funciones relacionadas con el desarrollo y crecimiento fetal, tiene la capacidad de adaptarse a diferentes condiciones del entorno.
Estos resultados nos llevan a concluir que la apoptosis es un proceso biológicamente muy importante que contribuye a la correcta formación de la placenta y a la formación correcta de la estructura placentaria, llevando a buen término la preñez.
Debido a que la acción de los glucocorticoides sobre el estrés es generalizada, afectando a la mayoría de los tejidos, como la placenta, uno puede especular que al estrés crónico aplicado a madres gestantes puede general un ambiente desfavorable para el desarrollo del feto.
De acuerdo con los resultados obtenidos a partir de la inmunolocalización de Caspasa-3 podemos concluir que en todos los estadios gestacionales analizados y en ambos grupos, la apoptosis se produce a través de una vía caspasa-dependiente.

CONCLUSIONES

  • En el grupo control y estrés la apoptosis disminuye hacia el día 17 y aumenta hacia el día 21.
  • Se observan diferencias significativas entre los estadios gestacionales estudiados, pero no entre los tratamientos.
  • Se observa apoptosis en ambas zonas placentarias. En la ZL principalmente en las CS y en la ZU, en las CGT.
  • En todos los casos analizados, teniendo en cuenta tanto el estadio gestacional como los grupos estudiados, la apoptosis se realiza por un proceso caspasa-dependiente.

 

BIBLIOGRAFÍA

  1. Acar, N.; Turkay Korgun, E.; Cayli, S.; Sahin, Z.; Demir, R.; Ustunel, I. (2008). Is there a relationship between PCNA expression and diabetic placental development during pregnancy? Acta histochemica. 110: 408-417.
  2. Acevedo Gallegos, S.; Espino y Sosa, S.; Gallardo Gaona, J.; Velázquez Torres, B.; Camargo artin, L.; Guzmán Huerta, M. (2008). La placenta humana: Revisión. Perinatal Reprod. Human. 22: 230-245.
  3. Ain, R.; Canham, LN.; Soares, MJ. (2003). Gestation stage-dependent intrauterine trophoblast cell invasion in the rat and mouse novel endocrine phenotype and regulation. Dev. Biol. 260: 176-190.
  4. Angosto, M. (2003). Bases moleculares de la apoptosis. Anal. Real. Nat. Farm. 69:36-64.
  5. Armario, A. (1981). Anterior pituitary response to stress: time-related changes and adaptation. Review. Int. Dev. Neurosci. 16 (3-4): 241-260.
  6. Austgulen, R.; Chedwick, L.; Vogt Isaksen, C.; Vatten, L.; Craven, C. (2002).  Trophoblast apoptosis in human placenta at term as detected by expression of a cytoketatin 18 degradation product of caspase. Arch Pathol Lab Med. 126:1480–1486.
  7. Barrio, E.; Calvo, MT.; Romo, A.; Alvarez, R.; Gutierrez, JI.; Fernandez Longas, A. (2003). Crecimiento intrauterino restringido: estudio de la apoptosis en la placenta. An. Pediatr. 58(2): 51-54.
  8. Burdon, C.; Mann. C; Cindrova-Davies, T.; Ferguson-Smith, AC; Burton, GJ. (2007). Oxidative stress and the induction of cyclooxygenase enzyme and apoptosis in the murine placenta. Placenta. 13:724-733.
  9. Burton, P.; Waddell, BJ. (1999). Dual function of 11-B hydroxysteroid dehydrogenase in placenta: modulating placental glucocorticoids passage and local steroid action. Biol. Reprod. 60:234-240.
  10. Chan, CC.; Lao, TT.; Cheung, AN. (1999). Apoptotic and proliferative activities in first trimester placentae. Placenta. 20: 223-227.
  11. Davies, J.; Glasser, SR. (1968). Histological and fine structural observations on the placenta of the rat. Act. Anat. 69: 542-608.
  12. Degterev, A.; Boyce, M.; Yuan, J. (2003). A decade of caspasas. Oncogene. 22 (53):8543-8567.
  13. Elinos-Báez, C.; Maldonado, V.; Meléndez-Zajgla, J. (2003). Caspasas: moléculas inductoras de apoptosis. Gac Méd Méx. Vol.139 No. 5.
  14. Georgiades, P.; Ferguson-Smith, AC.; Burton, GJ. (2002). Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23, 3–19.
  15. González, E. (2006). La placenta en la gestante diabética. Endocrinología Ginecológica y Reproductiva. Vol. 8: 16-22.
  16. Hua, Z.; Yuchen, L.; Xuesong, L.; Xiaodong, W. (1999). An APAF-1 cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosoma that activates procaspase-9. Journal of Biol. Chem. 274 (17): 11549-11556.
  17. Inder, WJ.; Prickett, CR.; Jane Ellis, M.; Hull, L.; Reid, R.; Benny, PS.; Livesey, JH.; Donald, RA. (2001). The utility of plasma CRH as a predictor of preterm delivery. Journal of Clinical Endocrinol. And Metabol. 86(12): 5706-5710.
  18. Jerzak, M.; Bischof, P. (2002). Apoptosis en la placenta humana durante el primer trimestre: papel para mantener el privilegio inmune en la superficie materno-fetal y en el remodelado del trofoblasto. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology (Ed. Española). 2: 142-146.
  19. Kant, G.; Leu, J.; Anderson, S.; Mougey, E. (1987). Effects of chronic stress on plasma corticosterone, ACTH and prolactin. Physiol. Behav. 40: 775-779.
  20. Martí, O.; Andres, R.; Armario, A. (1999). Defective ACTH response to stress in previously stressed rats: dependence on glucocorticoids status. Am. J. Physiol. 227: 869-877.
  21. Mayer, N.; Greco, C.; Bertuzzi, M.; Rodriguez, N.; Vivas, A.; Gauna, H. (2011). Immobilization stress responses in adult rats exposed in utero to immobilization. Stress and health. 27: 1-10.
  22. Meresmann, G.; Olivares, C.; Vighi, S.; Alfie, M.; Irigoyen, M.; Etchepareborda, JJ. (2010). Apoptosis is increased and cell proliferation is decreased in out-of-phase endometria from infertile and recurrent abortion patients. Reprod. Biol. and Endocrinol. 8: 126.
  23. Mu, J.; Kanzani, T.; Si, X.; Tomimatsu, T.; Fukuda, H.; Shioji, M.; Murata, Y.; Sugimoto, Y.; Ichikawa, A. (2003). Apoptosis and related proteins in placenta of intrauterine fetal Death in prostaglandin F receptor-deficient mice. Biol. of. Reprod. 68: 1968-1974.
  24. Mulder, EJ.; Robles de Medina, PG.; Huizink, AC.; Van den Bergh, BR.; Buitelaar, JK.; Visser, GH. (2002). Prenatal maternal stress: effects on pregnancy and the (unborn) child. Early Human Development. 70: 3-14.
  25. Natelson, B.; Tapp, W.; Adamus, J.; Mittler, J.; Levin, B. (1981). Humoral indices of stress in rats. Physiol. Behav. 26: 104-109.
  26. Pijnenborg, R.; Varcruysse, LM. (2005). Duval on placental development in mice and rats. Placenta. 27: 109-18.
  27. Rodriguez, M.; Couve, C.; Egaña, G.; Chamy, V. (2011). Apoptosis placentaria: mecanismos moleculares en la génesis de la preclampsia. Rev. Chil. Obtet. Ginecol. 76 (6): 431-438.
  28. Rodriguez, N.; Mayer, N.; Gauna, H. (2007). Effects of prenatal stress on male offspring sexual maturity. Biocell. 31(1): 67-74.
  29. Shulkin, J. (1999). Corticotropin-releasing-hormone signals adversity in both the placenta and the brain; regulation by glucocorticoids and allostatic overload. J. Endocrinol. 161: 349-356.
  30. Soares, MJ.; Chapman, BM.; Rasmussen, CA.; Dai, G.; Kimei, T.; Orwig, KE. (1996). Differentiation of trophoblast endocrine cells. Placenta. 17: 277-289.
  31. Straszewski-Chavez, S.; Abrahams, VM.; Mor, G. (2005). The role of apoptosis in the regulation of trophoblast survival and differentiation during pregnancy. Endocrine reviews. 26(7): 877-897.
  32. Unek, G.; Ozmena, A.; Kipmen-Korgun, D.; Turkay Korgun, E. (2011). Immunolocalization of PCNA, Ki67, p27 and p57 in normal and dexamethasone-induced intrauterine growth restriction placental development in rat. Acta histochemica. 114: 31-40.
  33. Vigas, M.; Usdin, E.; Kventdansky, R.; Kopin, I. (1980). Contribution to the understanding of the stress: recent advance. Elsevier North. Pp. 573-583.
  34. Zou, H.; Li, X.; Wang, X. (1999). An Apaf-1 cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J. Biol. Chem. 274: 11549-11556.

ANEXOS

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