Identificación inmunohistoquímica de motilina en duodeno de fetos de caballo en diferentes etapas del desarrollo.

Autores:
Pascual G. Dauria1, Rosa A. Castagnino2, Virginia Mac Loughlin3, Liliana Sona4, Facundo Bonino5
1 Profesor Asociado,  Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto. Argentina.
2 Profesora Asociada Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto. Argentina
3 Ayudante de Primera,  Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto. Argentina.
4 Jefa de Trabajos Prácticos,  Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto. Argentina
5 Ayudante de Primera,  Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto. Argentina
Correo electrónico del primer autor pdauria@ayv.unrc.edu.ar

RESUMEN

El caballo criollo, como unidad productiva, provoca un gran impacto rentable, por lo que muchos son los aspectos a considerar para poder aportar nuevos conocimientos en lo que respecta a esta especie. Uno de esos aspectos es el sistema digestivo y más específicamente las hormonas gastrointestinales. Las mismas son secretadas por células endocrinas especializadas que se distribuyen a lo largo del tracto gastrointestinal ejerciendo un gran efecto no sólo en la regulación, movilidad y crecimiento del sistema digestivo sino también sobre las emociones y la conducta. Esto refleja la relevancia que dichas hormonas revisten en diferentes etapas del individuo como los son el  crecimiento y la reproducción, detectándose ya su presencia en la vida fetal del humano y del cerdo. Es  objetivo determinar a través de la técnica inmunohistoquímica  la presencia de motilina en duodeno de fetos de caballo en diferentes etapas de su desarrollo. Se utilizaron fetos de 120, 240 y 310 días de gestación obtenidos del frigorífico Aimar de Río Cuarto; los cuales fueron procesados inmediatamente de faenados. Se tomaron muestras de duodeno, las que fueron fijadas en formol bufferado al 10 %, incluidas en parafina y procesadas mediante la técnica histológica convencional. Para la determinación de motilina, las preparaciones histológicas obtenidas fueron sometidas a la técnica de inmunohistoquímica. Los resultados demostraron la presencia y distribución de la hormona gastrointestinal en estructuras como tejido conectivo, plexos nerviosos y tejido muscular con distintos grados de reactividad. Se concluye que motilina prevaleció en el período de gestación de 310 días.
Palabras Clave:
Motilina, fetos de caballo, inmunohistoquímica, duodeno

INTRODUCCIÓN

El caballo criollo (Equus caballus), mamífero perteneciente al Orden Perisodáctilos y a la Familia Équidos, provoca como unidad productiva un gran impacto rentable, por lo que muchos son los aspectos a considerar para poder aportar nuevos conocimientos en lo que respecta a esta especie. Uno de esos aspectos es el sistema digestivo y más específicamente las hormonas peptídicas denominadas hormonas gastrointestinales. Las mismas son secretadas por células endocrinas especializadas que se distribuyen a lo largo del tracto gastrointestinal (Pearce, 1969) y su estimulación nerviosa se lleva a cabo por vía parasimpática mientras que la inhibición es por vía simpática. Ejercen un gran efecto no sólo en la regulación, movilidad y crecimiento del sistema digestivo (Grube y Forsmann, 1979; Sjolund y Sundler, 1983; Toullec y Bernard, 1992), sino también sobre las emociones y la conducta (Usellini, 1990). Esto refleja la relevancia que dichas hormonas revisten en diferentes etapas del individuo como los son el  crecimiento y la reproducción (Uvnas-Moberg, 1989),  detectándose su presencia ya en la vida fetal del humano (Bryant y Boom, 1982) y del cerdo (Alumets y Sundler, 1983).  Los péptidos están formados por cadenas de aminoácidos que a su vez forman proteínas, se organizan en familias en base a estructuras relacionadas y con una secuencia peptídica común, ejemplo de esto son la gastrina y la colecistoquinina (CCK) por un lado, mientras que por otro tenemos la secretina, péptido inhibidor gástrico (GIP), el glucagón, el péptido intestinal vaso activo (VIP) y la motilina (Fang et al., 2004) entre otras. Los llamados neuropéptidos constituyen varias familias de moléculas que han mostrado ejercer efectos particulares a nivel del sistema nervioso, aunque muchos de ellos se descubrieron en el intestino.
Determinados péptidos se vinculan en forma preferencial con determinados tejidos o estructuras: gastrina, secretina y el péptido inhibidor de gastrina (GIP) se asocian al tejido epitelial; el péptido intestinal vasoactivo (VIP) y la sustancia P se relacionan con la lámina propia, submucosa y tejido muscular (Pederzoli et al., 2004); mientras que la motilina ejerce su efecto, especialmente, en el músculo (Ferri et al., 1983).
La presencia de las principales hormonas gastrointestinales (gastrina, secretina, colecistoquinina, motilina, entre otras) ha sido demostrada sobre todo en mamíferos y en algunas especies de peces (Bishop et al., 1984; Capella et al., 1996; Ceccarelli et al., 1990, 1995; Kitamura y Yamashita, 1984; Rojas García y Ronnestad, 2002; Usellini, 1990). Estas hormonas están acompañadas, a lo largo del tracto digestivo, por otras no menos importantes cuya función no es del todo conocida, a saber el péptido intestinal vasoactivo (VIP), la sustancia P, la somatostatina, la cromogranina y el neuropéptido Y (Alumets y Hakanson, 1997; Bishop et al., 1984; Capella et al., 1996; Chiba y Honma, 1995; Hannibal y Fahrenkrug, 2003; Hanusch y Roden, 2005; Rechlin, 1983). Además, las mismas se distribuyen en diferentes porciones del tracto digestivo como estómago, duodeno, yeyuno, íleon, colon y ciego (Ceccarelli et al., 1990; Ku et al., 2004;  Peranzi y Lehy, 1984; Rizzotti y Castaldo, 1980 a-b).
La motilina formada por 22 aminoácidos se secreta cada 100 minutos para estimular el complejo motor migratorio que ayuda a limpiar el estómago e intestino delgado de material sin digerir. Participa en el control de las contracciones del músculo liso del tracto digestivo alto (Chan-Palay et al., 1982; Fang et al., 2004).
Boivin et al., 1997; Depoortere (1995), Feighner et al., (1999)  y G Van Assche et al., (1995) han demostrado la presencia de receptores de motilina en el músculo liso asociados con sinaptosomas, expresándose en las neuronas entéricas del duodeno y colon humano. Situación similar fue hallada en tejido neural y muscular de duodeno y colon de conejos (Clark et al., 1999; Depoortere et al., 1991;Miller et al., 2000; Poitras et al., 1996), en duodeno de cobayo y perro (Poitras et al., 1987) y en el tracto digestivo de aves (De Clercq et al., 1996;Kitazawa et al., 1995). Mientras que estudios inmunohistoquímicos y de microscopía electrónica determinaron la no localización de células endocrinas positivas a motilina en el  epitelio duodenal de conejo (Fujimiya et al., 1998). Sin embargo Sakai et al., (2003) mostraron células inmunopositivas a motilina en el epitelio de las vellosidades y criptas del intestino delgado de rata pero no en estómago, ciego, colon y páncreas. Secor et al., (2001) demostraron en el tracto gastrointestinal del pitón la presencia de motilina en bajas concentraciones dependiendo del momento del proceso digestivo. Van Aswegen et al., (1996) encontró en el elefante africano células endócrinas inmunoreactivas a motilina en la mucosa intestinal. Por otra parte, O´Donohue et. al., 1990 identificaron motilina en cerebro y duodeno de rata, mientras que  Shin et al., (1980) y Usellini et al 1984 lo hicieron en cerdo, rata perro y humano.
En equinos se ha demostrado que la hormona en cuestión está involucrada en los mecanismos de regulación de la motilidad intestinal, principalmente en el yeyuno (Minocha and Galligan, 1991; Sasaki and Yoshihara, 1999). Según investigaciones efectuadas por diversos autores, la motilina puede ser considerada una hormona digestiva en especies como perro y rata, cumpliendo un rol fisiológico en el control de la inducción de la fase III del complejo interdigestivo migratorio en el intestino proximal (Fang et al., 2004; Katayama et al., 2005; Poitras, 1984); también en humanos se comprobó que interviene en la fase III del proceso interdigestivo (Kawamura et al., 1993). Por otro lado, investigaciones realizadas por Katayama et al., (2005) en intestino de cerdos sometidos a períodos de ayuno, demuestran que probablemente la motilina podría impedir la transmisión ganglionar presináptica en el plexo mientérico del íleon. Algunos efectos de la motilina sobre la secreción exocrina ha sido descripta por Fiorucci (1993), hallando que en el hombre  se asocia con la secreción de las glándulas salivales, en cambio, en el perro estimula la secreción de pepsinógeno y del páncreas. Nishikubo et al., (2005) identificaron células positivas a motilina en duodenos de  niños prematuros de veintidós semanas de gestación. Asimismo en intestino delgado, ciego y colon de búfalos de diferentes edades se estudió la distribución de distintas poblaciones celulares endocrinas, entre ellas las que secretan motilina (Lucini et al., 1999).
Debido a que en el periodo postnatal temprano de diferentes especies incluida el equino, existe una dotación de hormonas gastrointestinales que regulan la actividad fisiológica del tracto gastrointestinal, es de esperar que en el período prenatal se observe una situación similar, ya que la etapa crítica que representa el nacimiento requiere de un marco morfofisiológico apropiado para llevar a cabo las funciones vitales.
Por ello es objetivo de este trabajo identificar, por la técnica de inmunohistoquímica, la presencia de la hormona gastrointestinal motilina  en duodeno de feto de caballo y determinar el patrón de distribución de las mismas en las diferentes estructuras intestinales y en los tres períodos de gestación estudiados.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se utilizaron fetos de caballo de 120, 240 y 310 días de gestación (Roberts, 1971) obtenidos del frigorífico Aimar de Río Cuarto; los cuales fueron procesados inmediatamente, extrayéndoles el segmento del intestino delgado correspondiente a duodeno. Se tomaron muestras del mismo que fueron fijadas en formol bufferado al 10 %, continuándose en el laboratorio con las otras etapas del procesamiento correspondiente a la técnica histológica convencional.

Técnica histológica convencional
Las muestras permanecieron 24 horas en el fijador con la finalidad de preservar la morfología celular (Leong et al.; 1989). Posteriormente se las deshidrataron con alcoholes de graduación creciente, se las aclaró con xileno y se las incluyó en parafina. Los cortes se realizaron con un micrótomo computarizado y graduado en 3 micras, y luego fueron montados en portaobjetos. Las preparaciones histológicas obtenidas se sometieron a la técnica de inmunohistoquímica para la determinación de las hormonas gastrointestinales en estudio.

Técnica de inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica al combinar técnicas anatómicas, inmunológicas y bioquímicas, permite localizar componentes tisulares definidos ("in situ") mediante el empleo de anticuerpos específicos y de moléculas marcadoras (Field, 1984; Gimeno y Massone, 1998; Vissio, 2000).
Se utilizaron como marcadores, anticuerpos primarios contra motilina y  péptido intestinal vasoactivo; y como reveladores, el complejo universal avidina-biotina (ABC) y el substrato peroxidasa diaminobencidina (DAB).

Desde un punto de vista metodológico se siguieron los siguientes pasos:

Expresión de resultados
Los resultados obtenidos por medio del estudio inmunohistoquímico de los diferentes tejidos reaccionantes (conectivo, músculo, plexos nerviosos, se expresaron en forma cualitativa: reacción intensa (+++); reacción moderada (++); reacción débil (+); reacción negativa (-).
Para minimizar la subjetividad de las evaluaciones, las observaciones fueron realizadas por tres o más investigadores, quienes seleccionaron al azar los preparados histológicos en cuestión.

RESULTADOS

Descripción Histológica: El tracto intestinal de fetos de caballos comprende las siguientes regiones, intestino delgado (duodeno, yeyuno e íleon) e intestino grueso (ciego, colon y recto). El órgano en estudio (duodeno) presenta histológicamente las siguientes túnicas: mucosa, muscular y serosa. La mucosa presenta proyecciones o evaginaciones llamadas  vellosidades, las cuales están formadas por un epitelio cúbico simple con células  caliciformes y microvellosidades (chapa estriada) y  un corion submucoso de tejido conectivo laxo-denso; en algunas regiones se encuentran esbozos de glándulas intestinales. La túnica muscular es de tejido muscular liso y se dispone en una circular interna y una longitudinal externa. Hacia distal se encuentra la serosa de tejido conectivo laxo y  mesotelio (fig.1)
Estudio Inmunohistoquímico
La observación, interpretación y análisis efectuado de los datos correspondientes a diferentes regiones del tracto intestinal de fetos de caballo de diferentes edades, arrojó los siguientes resultados que se describen a continuación y se resumen en la Tabla 1.

Feto de 120 días de Gestación
Duodeno
Se observó  positividad moderada (++) en componentes del tejido conectivo de la túnica Serosa mientras que no se detectó reactividad  en los miocitos de la túnica Muscular (tabla 1).

Feto de  240 días de gestación
Duodeno
En las preparaciones histológicas del órgano en estudio se visualizó marcación en los plexos nerviosos mientéricos o de Auerbach localizados en el tejido conectivo que separa las dos capas musculares (circular interna y longitudinal externa). La intensidad de la reactividad fue moderada (++). (Tabla 1 y Fig. 2). En los demás tejidos no se observó reactividad.

Feto de 310 días de gestación
Duodeno
Se identificó en el tejido conectivo células que presentaron reactividad con un grado  de intensidad moderada (++) (Tabla 1). También se observó positividad en células de la muscular circular interna y longitudinal externa. Dichas células musculares reaccionaron con una intensidad de moderada (++) a intensa (+++) (Tabla 1 y Fig. 3).  

DISCUSIÓN

En el presente estudio fueron analizadas muestras de duodeno de fetos de caballo en determinadas etapas del desarrollo embrionario sometidas a la técnica de inmunohistoquímica para la determinación de la hormona gastrointestinal motilina.
Los resultados obtenidos del estudio inmunohistoquímico de motilina muestran, por un lado, un grado de reacción variable de las estructuras como tejido conectivo, plexos nerviosos y tejido muscular liso y por otro lado, un patrón de distribución diferencial en los períodos de gestación analizados.
Se observó reactividad en tejido conectivo, plexos nerviosos y tejido muscular liso.
En tejido conectivo se determinó positividad moderada en componentes que presentaron un aspecto difuso levemente granular. Resultados coincidentes se obtuvieron en estructuras de la mucosa intestinal del elefante africano (Van Aswegen et al., 1996), y en ratas donde, probablemente, la motilina participa controlando el patrón de contracciones del músculo liso en el tracto gastrointestinal alto. El estallido de secreción de dicha hormona se lo relaciona, temporalmente, con el comienzo de las contracciones y estimula el complejo motor migratorio que ayuda a limpiar el material no digerido del estómago y del intestino (Fang et al., 2004).
La inmunoreactividad en plexos nerviosos mientéricos fue de débil a moderada, lo que permitiría inferir la presencia de receptores en las neuronas intestinales como lo demostrado por Feigner et al., (1999) en neuronas entéricas del duodeno de humano.
En tejido muscular liso la reacción fue de moderada a intensa; similar situación fue observada en el músculo liso duodenal de humano (Boivin et al., 1997; G Van Assche et al., 1997), en gatos, perro, conejos y pollo (Clark et al., 1999; Depoortere et al., 1995; Poitras et al., 1987), identificándose receptores asociados con sinaptosomas y dos clases de receptores, uno para músculo liso y otro para neuronas y que a la vez difieren según las especies. En duodeno de humano se determinó que motilina quizás participe en la fase III del proceso de interdigestión gastrointestinal aunque su actividad es menor que en el estómago (Kawamura et al., 1993; Miller et al., 2000). Podría afectar el complejo mioeléctrico migratorio que se origina en el estómago o duodeno. Poitras (1984) también demostró que la motilina, en perros, puede ser considerada como una hormona que tiene el rol fisiológico de controlar la inducción de la fase III del proceso mencionado anteriormente. En duodeno de ratas se identificó que la motilina presente es la de bajo peso molecular mientras que en cerebro está presente la de alto peso molecular (O’Donohue et al., 1990). Estudios inmunohistoquímicos comparativos en diversas especies como cerdo, rata, perro y humano permitieron demostrar que el mayor pico de motilina inmunoreactiva se dio en el cerdo (Shin et al., 1980).
En tejido epitelial no se observó reacción a motilina. En cambio, Sakai et al., (2003) demostraron, en ratas, la presencia de esta hormona en células epiteliales de las vellosidades y de las criptas, de forma alargada o poligonal. Asimismo, Fujimiya et al., (1998) identificaron en conejos, células epiteliales duodenales positivas que se caracterizan por poseer gránulos redondeados, de tamaño mediano y ubicados en la región basal y perinuclear del citoplasma. Usellini et al., (1984) localizaron esas células en perros y humanos y presentaban la particularidad de poseer gránulos pequeños y redondeados en el hombre y de forma irregular en el perro. Estos autores sostienen que la presencia de motilina en este tejido podría cumplir un rol en la diferenciación y  crecimiento del epitelio intestinal.
Con respecto al patrón de aparición durante el desarrollo fetal se observó que la reactividad a motilina aumenta a medida que avbanza el desarrollo. Lucini et al., (1999) demostró que durante la etapa postnatal de búfalos, las hormonas gastrointestinales muestran cambios en su frecuencia y distribución. En caso de motilina hay un leve aumento con la edad. Cabe destacar que las células endocrinas se mantienen constantes en todos los estadíos, en cambio las hormonas que contienen varían durante el desarrollo ya que probablemente están involucradas en las diferentes fases del proceso alimentario, con el tipo de alimento y cumplen un rol en el crecimiento del intestino. Por otra parte, Nishikuba et al., (2005) determinó la presencia de células positivas a partir de las 22 semanas de gestación en duodeno de infantes prematuros.

CONCLUSIONES

Se concluye que:
Se determina la presencia de motilina en diferentes estructuras del duodeno.
Con respecto a la arquitectura histológica intestinal, la hormona gastrointestinal analizada se encuentra presente en tejido conectivo, plexo nervioso y tejido muscular.
Con respecto al período de gestación, la hormona motilina se expresa en los tres períodos estudiados, predominando en aquel correspondiente a los 310 días de gestación.
Lo expuesto puede deberse a cambios fisiológicos-alimentario, de crecimiento, patológicos, entre otros, que modifican la expresión de los receptores hormonales en dichas situaciones. Los resultados obtenidos pueden, por lo tanto, ser la base para posteriores estudios que pongan en  evidencia en qué momento del desarrollo embrionario aparecen las hormonas gastrointestinales y que rol cumplen en el desarrollo del tracto digestivo.

BIBLIOGRAFÍA

1. Alumet, J. and F. SUNDLER (1983) Ontogenic of  endocrine cells in porcine gut and pancreas. Gastroenterology. 85: 1372-1395.
2. ALUMETS, J. and R. HAKANSON (1997) Distribution ontogenic and ultrastructure of somatostatin inmuno reactive cells in the pancreas and gut. Cell Tis. Res. 185: 465-479.
3. BISHOP, A.; N. HODSON; J. MAJOR; S. BLOOM and J. POLAK (1984) The regulatory peptide system of the large bowel in equine. Experientia 40(8): 801-806.
4. BOIVIN, M., P. RIVERO., S. ST-PIERRE and P. POITRAS (1997) Neural mediation of the motilin motor effect on the human antrum. Gastroenterology 272: 71-76
5. BRYANT, M. G. and S. R. BOOM (1982) Development of intestinal regulatory peptides in the human fetus. Gastroenterology 83: 47-54.
6. CAPELLA, C., E. SOLCIA and M. VASALLO (1996) Identification of six types of endocrine cells in gastrointestinal mucosa of the rabbit. Histolological Japonica. 30: 479-495.
7. CECCARELLI, P., V. PEDINI and A. GARGIULO (1990) Cellule endocrine del sistema GEP nell intestino di cavallo. Atti societá Italiana Scienze Veterinarie XLIV: 311-313.
8. CECCARELLI, P., V.  PEDINI and A. GARGIULO (1995) Serotoning – containing cells in the horse gastrointestinal tract. Anatatomy Histology and Embryology. 24: 97-99.
9. CHAN-PALAY, V., M. ITO., P. TONGROACH., M. SAKURAI and S. PALAY (1982) Inhibitory effects of motilin, somatostatin and taurine in enteric neurons. Neurobiology. 79: 3355-3359.
10. CHIBA, A. and J. HONMA (1995) Occurrence of neuropeptide Y (NPYO) like immunoreactive in the vellointestinal duct and yolk sac of two species of elasmobranch. Zoological Science 12: 611-614.
11. CLARK, M., T. WRIGHT., P. BERTRAND., M. VERLINDEN and J. FURNESS (1999) Motilin receptors in the rabbit duodenum. Clinical Experimental Pharmacology Phisiology. 26: 242-245.
12. DE CLERCQ, P., I. DEPOORTERE., M. MACIELAG., A. VANDERMEERS and T. PEETERS (1996) Isolation, sequence and bioactivity of motilin in chicken. Peptides 17: 203-208.
13. DEPOORTERE, I., T. PEETERS and G. VANTRAPPEN (1991) Motilin receptors of the rabbit colon. Peptides 12: 89-94.
14. DEPOORTERE, J. (1995). Involvement of motilin receptors. Hormone Metabolisme. 24: 45-51.
15. FANG, P., L. DONG., Y. LUO., X. LONG WAN and N. CHAI (2004) Effects of motilin and ursodeoxycholic  acid on gastrointestinal  myoelectric activity of different origins in fasted rats. World Journal of Gastroenterology 10 (17): 2509-2513.
16. FEIGHNER, S., C. TAN., S. PONG., C. AUSTIN., M. CASCIERI., R. STOCCO and A. HOWARD (1999) Receptor for motilin identified in the human gastrointestinal system. Science. 284: 2184-2188.
17. FERRI, G., T. ADRIAN and M. GHATEL (1983) Tissue localization and relative distribution of regulatory peptide in separated layers from the human bowel. Gastroenterology 84: 777-786.
18. FIELD, A. (1984) Technical aspects of immunocytochemistry and its application in routine histopathologyc. Histologic: 3: 211-213.
19. FIORUCCI, A. (1993) Effects of motilin on exocrine secretions. Digestive Disease Science 44: 1000-1006.
20. FUJIMIYA, M., K. OKUMIYA., Y. KWOK., S. ST-PIERRE and C. MCINTOSH (1998) Immuno-electron microscopic study of differential localization of motilin in the duodenal epithelium. Peptides. 19: 65-73.
21. G VAN ASSCHE, T., I. THIJS., T. DEPOORTERE and L. PEETERS (1997) Excitarory effect of motilin on the isolated human colon. Gastroenterology. 108: 70-73.
22. GIMENO, E. and A. MASSONE (1998) Técnicas inmunohistoquímicas en patología veterinaria: aspectos teóricos y prácticos. Vet. Arg. 6:332-339.
23. GRUBE, D. and W. FORSMANN (1979) Morphology and function of the enteroendocrine cells. Hormone Metabolisme Research. 11:589-606.
24. HANNIBAL, J. and J. FAHRENKRUG (2003) Circadian rhythm regulation: a central role for the neuropeptide VIP. AJP- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 285: 935-939.
25. HANUSCH, U. and M. RODEN (2005) News in gut - brain communication: a role of peptide YY in human. Europeau Journal Clinical 35 (7): 425-430.
26. KATAYAMA, Y., Y. NODA., K. HIRAI and K. HONDA (2005) Motilin inhibits ganglionic transmisión in the myenteric plexus of the guinea-pig ileum. Neuroscience Research 25: 120-126.
27. KAWAMURA, O., T. SEKIGUCHI., M. KUSANO., T. NISHIOKA and Z. ITOH (1993) Effect of erythromycin onn interdigestive gastrointestinal contractile activity and plasma motilin concentration in humans. Digestive Disease Science 38: 870-876.
28. KITAMURA, N.J. and T. YAMASHITA (1984) Inmunocitochemical distribution of endocrine cells in the gastrointestinal tract of the horse. Equine Vet. 1. 16: 103-107.
29. KITAZAWA, T., T. TANEIKE and A. OHGA (1995) Excitatory action  of motilin on the gastrointestinal smooth muscle isolated from the chicken. Peptides. 16: 1243-1252.
30. KU, S., J. LEE and H. LEE (2004) Immunohistochemical study on the endocrine cells in gut of the stomachless teleost Zacco platypus. Anatomy Histology Embriology. 33 (4): 212-219.
31. LEÓN, A.S. (1989) New Tecnologies for the surgical pathologist. Journal Medicine Laboratory  Science. 4: 45-48
32. LUCINI, C., P. GIROLAMO., L. COPPOLA., G. PAINO and L. CASTALDO (1999) Postnatal development of intestinal endocrine cell populations in the water buffalo. Journal of Anatomy. 195: 439-446.
33. MILLER, P., L. TRUDEL., S.  ST-PIERRE., H. TAKANASHI and P. POITRAS (2000) Neural and muscular receptors for motilin in the rabbit colon. Peptides. 17: 56-62.
34. MINOCHA, A and J. GALLIGAN (1991). Erythromycin inhibits contractions of nerve-muscle preparations of the guinea pig small intestine. Journal Pharmacology Experiential Therapeutic. 257: 1248-1252.
35. NISHIKUBO, T., A. YAMAKAWA., H. KAMITSUJI and M. FUJIMURA (2005) Identification of motilin cells duodenal epithelium of prematures died. Gastroenterology  47: 248-251.
36. O´DONOHUE, T., M. BEINFELD., T. CHEY.,  E. ZIMMERMAN and D. JACOBOWITZ (1990) Identification, characterization and distribution of motilin immunoreactivity in the rat central nervous system. Peptides. 2: 467-477.
37. PEARCE, A.G. (1969) The cytochemistry and ultraestructure of polypeptide hormone producing cells of the 38. APUD series and the embryologic phisiologic and pathologic implication of the concept. J. Histochemistry and  Cytochemistry. 17:303-313.
39. PEDERZOLI, A., I. BERTACCHI., A. GAMBARELLI and L. MOLA (2004) Immunolocalisation of vasoactive intestinal peptide and substance P in the developing gut of Dicentrarchus labrax. European Journal Histochemistry. 48(2): 179-184.
40. PERANZI, G. and Y. LEHY (1984) T. Endocrine cells populations in the colon and rectum of cat, dog and monkey fine structure, immunocytochemistry and distribution. Anat. Rec. 240:87-100.
41. POITRAS, P. (1984) Motilin is a digestive hormone in the dog. Gastroenterology. 87: 909-913.
42. POITRAS, P., R.LAHAIE., S. ST-PIERRE and L. TRUDEL (1987) Comparative stimulation of motilin duodenal receptor by porcine or canine motilin. Gastroenterology. 92: 658-662.
43. POITRAS, P., P. MILLER and M. DICKNER (1996) Heterogeneity of motilin receptors in the gastrointestinal tract of the rabbit. Peptides. 17: 701-707.
44. RECHLIN, S. (1983) Somatostatin. I. New. England. Journal Medical. 309:1495-1501.
45. RIZZOTTI, M and L. CASTALDO (1980 a) The endocrine cells of the rectum of adult Ox Bassic Aplication Histochemmistry 23:235-249.
46. RIZZOTTI, M and L. CASTALDO (1980 b) The endocrine cells of the pyloric gland of adult Ox Bassic Application Histochemistry 24:33-52.
47. ROBERTS, S. (1971) Veterinary obstetrics and genital diseases. Clinical Biochemistry. 2: 138-150.
48. ROJAS GARCÍA, C. and I. RONNESTAD (2002) Cholecystokinin activity in the gut and body of developing Atlantic halibut larvae: evidence for participation in the regulation of protein digestion. Journal of Fish Biology. 61 (4): 973-986.
49. SAKAI, T., M. SATOH., H. KOYAMA., M. UMAHARA and Z. ITOH (2003) Localization of motilin-immunopositive cells in the rat intestine by light microscopic immunocytochemistry. Peptides. 15: 987-991.
50. SASAKI, N. and T.YOSHIHARA (1999) The effect of motilin on the regulation mechanism of intestinal motility in conscious horses. Journal Veterinary Medical Science 61: 167-170.
51. SECOR, R (2001) Vasoactive intestinal peptide determination in the gastrointestinal tract in vertebrales Neuropeptides 50: 116-123.
52. SHIN, S., K. IMAGAWA., E. SHIMIZU., K. NAGAI and N. YANAIHARA (1980) Heterogeneity of immunoreactive motilin. Endocrinology Japanica 1: 141-149.  
53. SJOLUND, K. and F. SUNDLER (1983) Endocrine cells in humane intestine and immunocytochemical study. Gastroenterology 85:1120-1130.
54. TOULLEC, R. and C. BERNARD (1992) Early-life patterns of plasma gut regulatory peptide levels in calves. Effects of age, weaning and feeding. Comparative Biochemistry and Physiology 102:203-209. 
55. USELLINI, L., A. BUCHAN., J. POLAK., C. CAPELLA and E. SOLCIA. (1984) Ultrastructural localization of motilin in endocrine cells of human and dog intestine by the immunogold  technique. Histochemistry. 81: 363-368.                         
56. USELLINI, L. (1990) Ultrastructural identification of human secretin cells by the immunogold technique their costorage of cromogranim A and serotonin. Histochemistry 94:113-120.
57. UVNAS-MOBERG, K. (1989) El tracto gastrointestinal durante el crecimiento y la reproduccion. Investigacion y Ciencia. 20: 48-54.                                                                                                                                                           
58. Van ASEWEGEN, G., S. VAN NOORDEN., S. KOTZE., V. DE VOS and J. SCHOEMAN (1996) The intestine and endocrine páncreas of the African elephant: a histological, immunocytochemical and immunofluorescence study. Journal of Veterinary Research 63:335-340.
59. VISSIO, P. (2000) Técnicas inmunohistoquímicas. En guía de curso de Postgrado. Departamento de Ciencias Biológicas. Cap. 5: 21-23. Facultad de Ciencias Exactas. UBA. Buenos Aires.

ANEXOS

Tabla 1.  Patrón de expresión  de las estructuras del duodeno para motilina en  
fetos de caballo en diferentes períodos  de gestación.

Referencias:      (+++) intensa reacción    (++) moderada reacción
(+)   débil reacción         (-)   reacción negativa       

 

Fig.1.- Microfotografía de duodeno de feto de caballo. H/E. Se observa la túnica mucosa con vellosidades (V) de epitelio cúbico simple con céls. calicifomes (C)  y corion submucoso (CS) con glándulas (G) (40x).

Fig. 2- Microfotografía de duodeno de feto de caballo de 240 días de gestación. Motilina. Se observa plexo nervioso reactivo (++) (PN) (25x).

Fig. 3.- Microfotografía de duodeno de feto de  caballo  de 310 días de gestación. Motilina. Se observan células  positivas (++) de la muscular circular interna (MC)  (40x).